Die Oligonucleotidsynthese am festen Träger ist ein komplexes, vielstufiges Verfahren. Die Herstellung erfolgt in 3’,5’-Richtung und erfordert vier Schritte für die Kettenverlängerung um eine Base:

1. Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Deblocking)

2. Kettenverlängerung durch kuppeln eines Amidites (Coupling)

3. Acetylierung von 5'-OH-Gruppen, die nicht reagiert haben (Capping)

4. Oxidation des Phosphittriester-Zwischenproduktes zum Phosphattriester (Oxidizing)

Die einzelnen Schritte verlaufen zwar mit sehr guten Ausbeuten, aber nicht quantitativ! Die Kupplungsausbeute hängt von der Sequenz und der Länge ab, wobei die Base G am schlechtesten kuppelt und ab einer Kettenlänge von ca. 50 Basen die Ausbeuten durch sterische Hinderung schlechter werden. An gut laufenden Synthesemaschinen unter Verwendung von erstklassigen Chemikalien werden je nach Länge und Sequenz Kupplungsausbeuten von 98- bis über 99 % erreicht.

Die nachfolgende Tabelle zeigt, daß die Gesamtausbeute stark von der durchschnittlichen Kupplungsrate abhängt und macht deutlich, daß auch bei kurzen Oligonucleotiden (20mer) und guter Kupplungsrate (99%) nur 83 % Volllänge erzielt werden.

Länge

Volllängenausbeute [%]

98 % Kupplungsrate

98,5 % Kupplungsrate

99 % Kupplungsrate

20mer

67

75

83

40mer

45

55

68

60mer

30

41

55

80mer

20

30

45

100mer

13

22

37

Nach der Synthese enthält das Rohprodukt folgende Verunreinigungen:

 

Basenschutzgruppen und Salze

Damit der Aufbau der Internucleotidbindung selektiv erfolgt, müssen die heterozyklischen Basen geschützt sein. Klassische Schutzgruppen sind Benzoyl für Adenosin und Cytidin und Isobutyryl für Guanosin. Nach Abschluß der Synthese erfolgt eine Abspaltung mit Ammoniak. Die hierbei gebildeten Amide werden durch Fällung des Oligonucleotides entfernt.

 

Verkürzte Sequenzen ohne DMT-Gruppe

Die so genannten Trityl-Off verkürzten Sequenzen entstehen durch unvollständige Kupplungen und durch postsynthetischen Strangbruch. Bei optimal verlaufenden Standardsynthesen (20mer, Kupplungsausbeute 99 %) beträgt der Anteil ca. 20 %.

Der postsynthetische Strangbruch tritt bei der Ammoniakbehandlung an allen Positionen auf, an denen die heterozyklische Base abgespalten worden ist. Der Verlust der Base erfolgt unter sauren Bedingungen beim Deblocking hauptsächlich bei Adenosin und spielt bei längeren Oligonucleotiden eine Rolle. Die Trityl-Off verkürzten Sequenzen können ausgezeichnet durch HPLC-Aufreinigung entfernt werden.

 

Verkürzte Sequenzen mit DMT-Gruppe

Die so genannten Trityl-On verkürzten Sequenzen entstehen, weil die zur Kettenverlängerung durchgeführten chemischen Reaktionen nicht quantitativ verlaufen und durch postsynthetische Strangbrüche an Stellen, an denen die heterozyklische Base fehlt (Depurinierung). Die vollständige Abtrennung ist nur durch PAGE möglich.

 

Die Fa. PURIMEX bietet folgende Aufreinigungen an:

Entsalzung

Die Entsalzung durch Ethanolpräzipitation entfernt vollständig alle Basenschutzgruppen und Salze. Kürzere Fehlsequenzen (< 10 Basen) bleiben weitgehend im Überstand. Ab einer Länge von 35 Basen ist eine HPLC-Aufreinigung erforderlich. Der Preis für die Entsalzung ist im Basenpreis enthalten!

Die festen Liefermengen betragen 2 nmol (10 nmol Maßstab), 10 nmol (50 nmol Maßstab), 50 nmol (200 nmol Maßstab) und 200 nmol (1000 nmol Maßstab)

 

Einfache HPLC Aufreinigung

Die Trityl-On-HPLC-Aufreinigung entfernt vollständig alle verkürzten Sequenzen, die keine Tritylgruppe enthalten. Zusätzlich erfolgt eine Abtrennung von Salzen und Basenschutzgruppen. Nach Abspaltung der als "handle" benutzten Tritylgruppe wird das Produkt durch Ethanol-Präzipitation isoliert und in Wasser gelöst. Anschließend wird die Ausbeute durch messen der UV-Absorption bei 260 nm bestimmt und das Oligonucleotid durch Zugabe von Wasser auf eine Konzentration von 100 µM eingestellt. Ab einer Länge von 35 Basen, wird diese Aufreinigung automastisch durchgeführt.

Die festen Liefermengen sind 1,2 nmol (10 nmol Maßstab), 6 nmol (50 nmol Maßstab),

30 nmol (200 nmol Maßstab) und 120 nmol (1000 nmol Maßstab).

Die HPLC-Aufreinigung von RNA bieten wir nicht an, da die Abtrennung der verkürzten Sequenzen nur mässig gelingt und das Verfahren schlecht reproduzierbar ist.

Bezeichnung

Preis [Euro]/Aufreinigung

10 nmol

50 nmol

200 nmol

1000 nmol

Einfache HPLC Aufreinigung

7

8

10

15

 

Doppelte HPLC Aufreinigung

Im Anschluß an die Trityl-On HPLC-Aufreinigung erfolgt nach Abspaltung der Tritylgruppe eine zweite HPLC-Aufreinigung. Hierdurch werden Oligonucleotide mit Basenmodifikationen und Trityl-On haltige verkürzte Sequenzen, die z.B. durch Strangbrüche nach erfolgter Synthese entstehen, weitestgehend entfernt.

Oligonucleotide, die einen Amino- oder Thiollinker haben, werden mindestens doppelt HPLC aufgereinigt

Die festen Liefermengen betragen 1 nmol (10 nmol Maßstab), 5 nmol (50 nmol Maßstab),

25 nmol (200 nmol Maßstab) und 100 nmol (1000 nmol Maßstab).

Bezeichnung

Preis [Euro]/Aufreinigung

10 nmol

50 nmol

200 nmol

1000 nmol

Doppelte HPLC Aufreinigung

14

15

20

30

 

Dreifache HPLC Aufreinigung

Bei der postsynthetischen Einführung von Farbstoffen via Amino-Oligo/NHS-Ester oder Thiol-Oligo/Maleimid wird das Produkt insgesamt dreimal HPLC aufgereinigt. Mit der 1. HPLC (TrOn) erfolgt eine Abtrennung des mit dem entsprechenden Amino-Linker bzw. Thiol-Linker versehenen Volllängenproduktes von den verkürzten Sequenzen, die keine Tritylgruppe enthalten. Nach der Entfernung der Tritylgruppe, einer Reaktion, die leider reversibel ist, erfolgt eine 2. HPLC (TrOff), um Trityl On haltige Sequenzen abzutrennen. Nach Isolierung des Produktes wird mit dem Farbstoff umgesetzt und anschließend mit der 3. HPLC nicht markiertes Oligonucleotid und überschüssiger Farbstoff abgetrennt.

Die festen Liefermengen sind 4 nmol (50 nmol Maßstab), 20 nmol (200 nmol Maßstab) und 80 nmol (1000 nmol Maßstab).

Bezeichnung

Preis [Euro]/Aufreinigung

50 nmol

200 nmol

1000 nmol

Dreifache HPLC Aufreinigung

24

30

45

 

Vierfache HPLC Aufreinigung

Die vierfache HPLC Aufreinigung ist erforderlich bei doppelt markierten Oligonucleotiden, wenn sowohl ein Aminolinker als auch ein Thiollinker eingesetzt werden. In der 1. HPLC erfolgt die Isolierung des Vollängenoligos, dass 2 Tritylgruppen enthält (1x am Aminolinker, 1x am Thiollinker). Nach Abspaltung der Aminolinker-Tritylgruppe wird ein 2. mal TrOn aufgereinigt. Anschliessend wird in einem speziellen Verfahren die Tritylgruppe am Thiollinker entfernt und das TrOff Produkt in der 3. HPLC isoliert. Nach Umsetzung des Oligonucleotides mit den beiden Farbstoffen wird mit der 4. HPLC nicht markiertes Oligonucleotid und überschüssige Farbstoffe abgetrennt.

Die festen Liefermengen sind 3,5 nmol (50 nmol Maßstab), 17,5 nmol (200 nmol Maßstab) und 70 nmol (1000 nmol Maßstab).

Bezeichnung

Preis [Euro]/Aufreinigung

50 nmol

200 nmol

1000 nmol

Vierfache HPLC Aufreinigung

32

40

60

 

Fünffache HPLC Aufreinigung

Wenn die doppelt markierte Sonde besonders sauber sein soll, erfolgt nach der 1. Farbstoffmarkierung die 4. HPLC. Nachdem das Produkt mit dem 2. Farbstoff umgesetzt worden ist, erfolgt die Abtrennung von überschüssigem Farbstoff und einfach markierten Oligo in einer 5. HPLC.

Die festen Liefermengen sind 3 nmol (50 nmol Maßstab), 15 nmol (200 nmol Maßstab) und 60 nmol (1000 nmol Maßstab).

Bezeichnung

Preis [Euro]/Aufreinigung

50 nmol

200 nmol

1000 nmol

5x HPLC Aufreinigung

40

50

75

 

Polyacrylamidgelelektophorese (PAGE) Aufreinigung DNA/RNA

Die PAGE Aufreinigung unter denaturierenden Bedingungen ist das am besten geeignete Verfahren zur Gewinnung hochreiner Oligonucleotide, insbesondere in Kombination mit HPLC. Die Auftrennung erfolgt nach Ladung und Masse bzw. globulärer Struktur. Nach der Synthese und Abspaltung der Schutzgruppen wird bei DNA zunächst eine zweifache HPLC (TrOn/TrOff, nicht im Preis enthalten) durchgeführt. Im Anschluss erfolgt die PAGE Aufreinigung.

RNA liefern wir ausschließlich PAGE aufgereinigt aus, da der Anteil an Volllängenprodukt im Vergleich zur DNA, bedingt durch deutlich schlechtere Kupplungsausbeuten, sehr viel niedriger ist. Eine HPLC bieten wir aus Qualitätsgründen nicht an. Das Rohprodukt wird nach Schutzgruppenabspaltung direkt übers Gel aufgereinigt. Nach der Isolierung des Volllängeproduktes wird eine Sep-Pak® -Entsalzung (nicht im Preis enthalten) durchgeführt. Wenn RNA mit Farbstoffen postsynthetisch markiert werden soll, ist eine 2. SepPak Entsalzung erforderlich.

Die Aufreinigung von Oligonucleotiden mit PAGE führt zu hochreinen Produkten.

Die festen Liefermengen bis zu einer Kettenlänge von 50 Basen sind 2 nmol (50 nmol Maßstab), 10 nmol (200 nmol Maßstab) und 50 nmol (1000 nmol Maßstab).

Bezeichnung

Preis [Euro]

PAGE Aufreinigung DNA

100

PAGE Aufreinigung RNA

100

 

Sep-Pak®-Entsalzung DNA/RNA

Nach der PAGE Aufreinigung werden die Produkte über eine Kartusche entsalzt. Bei Farbstoffmarkierungen von RNA ist eine weitere SepPak Entsalzung erforderlich

Bezeichnung

Preis [Euro]

Sep-Pak® -Entsalzung DNA

20,00

Sep-Pak® -Entsalzung RNA

30,00

Doppelte Sep-Pak® -Entsalzung RNA

60,00

 

Sterilfiltration

Oligonucleotide, die in Zellkultur eingesetzt werden, werden nach der Präzipitation in hochreinem, DEPC behandeltem Wasser gelöst und direkt in die Verpackungseinheit durch eine 0,2 µm Membran filtriert.

Bezeichnung

Preis [Euro]

Sterilfiltration

10,00

 

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