Der Bedarf an farbstoffmarkierten Oligonucleotiden ist in letzter Zeit sprunghaft angestiegen. Die wichtigsten Einsatzgebiete sind:

  • Sequenzierung
  • Mutationsanalyse
  • Genotyping
  • Multiplex PCR
  • Quantitative PCR
  • In situ Hybridisierung (FISH)
  • Strukturaufklärung
  • Einzelmolekülspektroskopie
  • Enzymkinetik
  • Diagnostische Formate (Lightcycler™, TaqMan™ und Molecular Beacons)

Qualität von fluoreszenzmarkierten Oligonucleotiden

Ein Maß für die Qualität von markierten Oligonucleotiden stellt die emittierte Fluoreszenz dar, die in Abhängigkeit vom Farbstoff, der Menge des eingesetzten Oligonucleotides und der Umgebung bestimmte Werte erreichen sollte. Während ein zuviel an Fluoreszenz darauf hindeutet, daß freier bzw. nicht kovalent gebundener Farbstoff vorliegt, wird ein zu wenig an Fluoreszenz durch falsche Sequenzauswahl (bitte kein dG in direkter Nachbarschaft des Farbstoffes), schlechte Qualität der Bausteine bzw. durch falsche Produktionsbedingungen bei der Synthese und Aufreinigung verursacht. Hier sind insbesondere ungeeignete Abspaltungsreagenzien, unvollständige Entfernung nicht markierter Nucleinsäuresequenzen, schlechte Abtrennung von Verunreinigungen wie Salzen und Schutzgruppenderivaten sowie falsche Bedingungen bei der Endbearbeitung, zu nennen.

Die Fa. PURIMEX kann auf eine mehr als 30jährige Erfahrung zurückgreifen. Wir setzen zur Herstellung unserer markierten Oligonucleotide nur Bausteine renommierter Hersteller ein. Wann immer es die Anforderungen zulassen benutzen wir die Aminolinker/NHS-Ester-Variante zur Einführung der Markierung, da sie, wenn die Qualität der Bausteine gut ist, schnell und nahezu quantitativ läuft. Desweiteren ist es ein sehr schonendes Verfahren und gestattet in Abhängigkeit des Farbstoffes, eine effiziente Abtrennung von nicht markierten Sequenzen und Verunreinigungen.

 

Verfahren zur Einführung von Farbstoffen/Haptenen

Die Einführung eines Farbstoffes/Haptenes in ein Oligonucleotid wird mit Hilfe folgender Verfahren durchgeführt, deren Vor- und Nachteile im Einzelnen dargestellt sind:

Einbau via Amidit

Der Farbstoff/das Hapten wird während der Synthese am 5'-Ende oder innerhalb der Sequenz (internal, Farbstoff/Hapten dT Amidit) durch kuppeln eines Amidits eingebaut. Nach Abspaltung des Oligonucleotides vom Träger und Entfernung der Schutzgruppen wird das Rohprodukt mit doppelter HPLC aufgereinigt.

Vorteile

  • Nahezu quantitative Reaktion
  • Überschüße können einfach entfernt werden
  • Minimaler zeitlicher Mehraufwand

Nachteile

  • Teure Bausteine
  • Nur wenige Verbindungen verfügbar (s. unten)
  • Erheblicher personeller Mehraufwand durch säubern der Synthesemaschinen
  • Beeinträchtigung der Fluoreszenz durch Einwirkung von drastischen Reagenzien

Wir empfehlen den Einsatz von Amiditen nur bei Doppelmarkierungen. Bei Einzelmarkierungen sollte aus Qualitätsgründen NHS-Ester Bausteine eingesetzt werden.

 

CPG

Der Einbau des Farbstoffes/Haptens am 3'-Ende erfolgt durch Einsatz eines polymeren Trägers, an den das Derivat bereits gebunden ist. Nach Abspaltung des Oligonucleotides vom Träger und Entfernung der Schutzgruppen wird das Rohprodukt mit doppelter HPLC aufgereinigt.

 

Vorteile

  • Minimaler zeitlicher Mehraufwand

Nachteile

  • Teure Ausgangsstoffe
  • Nur wenige Bausteine verfügbar (s. unten)
  • Modifikation wird bei jedem Kettenverlängerung Säure und Base ausgesetzt.
  • Schwierige Aufreinigung, da auch verkürzte Sequenzen den unpolaren Rest tragen.

Wir empfehlen den Einsatz von CPG-Bausteinen nur bei Doppelmarkierungen. Bei Einzelmarkierungen sollte aus Qualitätsgründen NHS-Ester Bausteine eingesetzt werden.

 

NHS-Ester

Bei der Oligosynthese wird ein entsprechender Aminolinker am 5'-Ende, innerhalb der Sequenz oder am 3'-Ende eingebaut. Das Amino-Oligo wird durch doppelte HPLC aufgereinigt (TritylOn/TrOff). Anschließend wird spezifisch ein Farbstoff/Hapten-NHS-Ester gekuppelt und eine weitere HPLC trennt nicht markiertes Oligonucleotid und überschüssigen Farbstoff/Hapten ab. Es existieren Aminolinker, die es gestatten die funktionelle Gruppe am 5'-Ende (Aminolinker C6), innerhalb der Sequenz (internal) an jedem dA, dG, dC, T (Aminolinker-dA/dG/dC/T) bzw. rU oder am 3'-Ende (Aminolinker-CPG) zu positionieren.

Vorteile

  • Sehr viele, auch diastereomerenreine Farbstoffe verfügbar.
  • Hohe Flexibilität, Farbstoff kann an jeder Stelle des Oligos eingeführt werden.
  • Hohe Qualität der Produkte durch dreifache HPLC und schonende Bedingungen.
  • Geringer Anteil an unmarkierten Sequenzen
  • Wenig verkürzte, markierte Oligonucleotide

Nachteile

  • Zeitaufwendig durch länger dauernde Markierungsreaktion und dreifache HPLC-Aufreinigung
  • bei stark intercalierenden Verbindungen wie z.B. TAMRA ist die vollständige Abtrennung des Farbstoffüberschusses nur durch PAGE-Aufreinigung möglich

Wir empfehlen aus Qualitätsgründen Einzelmarkierungen immer mit der NHS-Ester-Methode via Aminolinker durchzuführen.

 

Maleimid

Bei der Oligosynthese wird ein entsprechender Thiol-Linker am 5'-Ende oder am 3'-Ende eingebaut. Das Thiol-Oligo wird durch doppelte HPLC oder in Kombination mit Aminolinker durch dreifache HPLC aufgereinigt (TritylOn/TrOff). Anschließend wird spezifisch ein Farbstoff/Hapten-Maleimid gekuppelt und eine weitere HPLC trennt nicht markiertes Oligonucleotid und überschüssigen Farbstoff/Hapten ab.

 

Vorteile

  • Hohe Qualität der Produkte durch dreifache HPLC und schonende Bedingungen
  • Geringer Anteil an nichtmarkierten Sequenzen
  • Wenig verkürzte, markierte Oligonucleotide

 

Nachteile im Vergleich zum NHS-Ester-Verfahren

  • Nur die Firmen ATTO-TEC und Dyomix bieten Ihre komplette Produktpalette auch als Maleimide an. Andere Hersteller haben nur wenige Standardfarbstoffe im Angebot.
  • Geringere Flexibilität, da es keine Bausteine gibt, mit der die Thiol-Funktion und somit der Farbstoff innerhalb der Sequenz positioniert werden kann.
  • Schlechtere Ausbeute bei der Markierungsreaktion, woraus eine vom verwendeten Farbstoffes abhängige, mehr oder weniger schlechtere Qualität resultiert.

Aufgrund dieser Nachteile setzen wir Maleimide nur bei Doppelmarkierungen ein, wenn kein Amidit als 1. Komponente verfügbar ist oder eine freie Aminfunktion zum Beispiel für eine Immobilisierung benötigt wird und der Farbstoff am anderen Ende stehen soll. Die Selektivität des Maleimides mit Thiolgruppen zu reagieren, ist in Gegenwart eines freien Aminolinkers zwar nicht hundertprozentig, jedoch lassen sich die nicht gewünschten Verbindungen oftmals gut abtrennen

 

Doppelmarkierungen

Doppelt markierte Oligonucleotide werden für diagnostische Formate wie z.B. TaqMan™ und Molecular Beacons und für Strukturuntersuchungen via FRET benötigt. Zur selektiven Markierung eines Oligonucleotides mit verschiedenen Farbstoffen bieten wir 3 Verfahren an:

  1. Beide Fluorophore werden als Amidit- bzw. CPG-Bausteine eingeführt.
  2. Das eine Fluorophor wird als Amidit/CPG-Derivat und das Andere via     Aminolinker/Farbstoff-NHS-Ester eingeführt.
  3. Das 1. Fluorophor wird via Thiol/Maleimid und das 2. via Aminolinker/NHS-Ester eingeführt. Diese Möglichkeit erfordert eine vierfache HPLC Aufreinigung und die Ausbeute ist nur etwa halb so gross im Vergleich zu den ersten beiden Varianten.

 

Farbstoff/Hapten Amidite, einbaubar am 5'-Ende

Biotin, BHQ 1, BHQ 2, Cy3™, Cy3.5™, Cy5™, Cy5.5™, Dabcyl, DNP-TEG, Dy 780, Eclipse™ Quencher, Fluorescein, HEX, Redmond Red™, TET und Yakima Yellow™

 

 

Farbstoff/Hapten dT Amidite, einbaubar innerhalb der Sequenz

Biotin-dT, BHQ 1-dT, BHQ 2-dT Dabcyl-dT und Fluorescein-dT

 

Farbstoff/Hapten-CPG, einbaubar am 3'-Ende

Biotin, BHQ 1, BHQ 2, BHQ 3, Dabcyl, DNP-TEG, Eclipse™ Quencher, Fluorescein, Redmond Red™ und Yakima Yellow™

 

Farbstoff/Hapten-NHS-Ester, universell einbaubar

Alle Alexa Fluor® Derivate, AMCA, alle ATTO Derivate, Biotin, alle BODIPY® Derivate, alle Cy™ Derivate, Dabcyl, Dansyl, Digoxigenin, DMACA, DNP-TEG, alle Dyomics Derivate, Fluorescein, HEX, HYCO, Marina Blue®, MECO, Naphtofluorescein, alle Oregon Green® Derivate, Pacific Blue™, Pyren, alle QSY® Derivate, Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, ROX, R6G, SECCA, TAMRA, TET, Texas Red®

 

Farbstoff/Hapten-Maleimide, einbaubar am 5'- oder 3'-Ende

Viele Alexa Dervate, alle ATTO und Dyomix-Derivate, Biotin, BODIPY®499/508, BODIPY®577/618, BODIPY®TMR, Fluorescein, Oregon Green®488, PacificBlue/Orange™, Pyren, QSY®7/9, Rhodamine Red™, TAMRA 5/6, Texas Red®

Die Liefermengen von farbstoffmarkierten Produkten können nicht garantiert werden, da sie stark von der Qualität des reaktiven Farbstoffes abhängen. In der Regel werden aber bei den Maßstäben 50 nmol/200 nmol/1000 nmol 4 nmol/20 nmol/80 nmol erzielt. Bei vierfach HPLC aufgereinigten Verbindungen (Doppelmarkierungen mit Maleimiden und NHS-Estern) werden entsprechend 3,5 nmol, 17,5 nmol und 70 nmol geliefert.

Bei zusätzlicher PAGE-Aufreinigung liefern wir bei den Maßstäben 50/200/1000 nmol 2/10/50 nmol.

Der Preis beinhaltet nur das Farbstoff/Hapten-Derivat. Kosten für Basenkupplungen, Aminolinker und Aufreinigung werden extra berechnet.

 

Highlights von PURIMEX farbstoffmarkierten Oligonucleotiden

  • 100 % Volllänge bei 3x HPLC/PAGE aufgereinigten Oligos
  • Einführung des Farbstoffes an fast allen Positionen möglich
  • Wenig nicht markierte Sequenzen
  • Große Auswahl an Farbstoffen
  • Kaum freier Farbstoff enthalten
  • Hohe Intensität der Sonden
  • Niedriger Background

In den nachfolgenden Tabellen finden Sie die große Palette der von PURIMEX angebotenen Farbstoffe und Haptene geordnet nach Absorptionswellenlänge bzw. in alphabetischer Reihenfolge. Wichtige Informationen zu den einzelnen Produkten wie Fluoreszenzeigenschaften, Struktur, Einbaubarkeit, Anwendungsmöglichkeiten und Literaturhinweise erhalten Sie im Internet unter http://www.purimex.com

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